人類大腦是生物演化的奇跡。準確理解大腦的結構與功能是當前最具挑戰性的前沿科學問題，我國亦是將“腦科學”列為了國家重點前沿科技項目。一直以來，人類試圖通過各種技術和方法去解釋具有共同祖先的四足動物（從早期四足類動物，到現在爬行類、鳥類及哺乳類等陸生動物）如何演化出迥異的大腦特征，為何被視為“低等”的動物大腦具有神奇的再生能力？而作為兩棲動物的蠑螈，其大腦部分組織損傷后能重生復原，再生的神經元與損傷前高度相似，且蠑螈是與羊膜動物最接近的近親之一。這提示利用蠑螈研究腦細胞類型、神經元連接和功能等，有望破解再生修復人類大腦的奧秘，并可能為大腦部分疾病的臨床治療指明方向。
2022年9月2日，由杭州華大生命科學研究院主導，聯合來自3個國家17個單位的科學家共同組成的研究團隊，基于華大自主研發的時空組學技術Stereo-seq，分析了蠑螈大腦發育和再生過程，構建了首個蠑螈腦再生時空圖譜（Science封面：Stereo-seq鑒定蠑螈端腦再生過程中的重要神經干細胞亞型），這項成果以背靠背的形式發表于國際頂刊Science，同期，以特刊的形式，連發了3篇相關文章，深入到細胞層面，聚焦不同細胞類型在大腦演化中扮演的角色，展示了爬行動物和兩棲動物大腦演化過程中的關鍵創新。在此，“華大時空”將陸續推出對其余3篇文章主要內容的解讀，敬請關注。
本期推出的是奧地利維也納生物中心、瑞士蘇黎世聯邦理工學院等研究團隊的一項研究：蠑螈大腦中能否再生出所有細胞類型，包括腦區間的連接？這項研究中，使用snRNA-seq、snATAC-seq和空間轉錄組等技術來分析蠑螈端腦的細胞多樣性，鑒定了蠑螈谷氨酸能神經元和γ-氨基丁酸能神經元，并通過比較分析確定了它們在羊膜動物中的保守性。本研究提供了對四足動物神經系統的組織、進化和再生的新見解。以下是文章的詳細解讀。
文章題目：Single-Cell Analyses of Axolotl Telencephalon Organization, Neurogenesis, and Regeneration
發表時間：2022-09-02
發表期刊：Science
主要研究團隊：奧地利維也納生物中心、瑞士蘇黎世聯邦理工學院等
影響因子：63.714
DOI：10.1126/science.abp9262
研究背景
比較不同動物之間的大腦是分析大腦結構的進化起源和多樣性的一種手段。scRNA-seq和snRNA-seq提高了脊椎動物腦細胞識別和發育的分辨率。兩棲動物墨西哥鈍口螈（Ambystoma mexicanum）是與羊膜動物最接近的近親之一，適合于腦細胞類型、神經元連接和功能的比較研究。蠑螈能夠通過激活神經再生來修復背側區域損傷后的端腦。有神經系統的后生動物都能發現神經發生，成年小鼠室下區的細胞中可以不斷進行神經發生，但腦損傷后幾乎沒有神經發生。蠑螈和哺乳動物神經發生之間的分子關系還未被研究，蠑螈大腦中的動態平衡和再生神經發生之間的異同尚不清楚。因此，研究人員使用單細胞分析穩態和再生期間的蠑螈端腦的細胞類型多樣性和穩態神經發生的分子變化。
研究樣本
白色墨西哥鈍口螈，所有測序實驗均使用大小為10~11 cm的蠑螈。
研究策略
使用snRNA-seq、snATAC-seq和空間轉錄組技術來確定蠑螈端腦的細胞多樣性，確定區域分布的神經元、室管膜膠質細胞和神經母細胞；通過比較分析確定它們在羊膜動物細胞中的保守性。使用克隆追蹤、軌跡分析和多組學測序來分析蠑螈中穩態神經發生的細胞和分子變化及其與成年小鼠神經發生的關系。通過分析再生神經發生，確定了與穩態神經發生的異同，并發現再生神經元重新建立了來自端腦其他區域的神經元輸入。
研究成果
1. 蠑螈端腦的單細胞圖譜
研究人員利用顯微切割獲得端腦內側、背側和外側區域樣本，并使用snRNA-seq對這些區域進行分析，通過計算整合了蠑螈的48,136個細胞核，鑒定出95個分子水平不同的神經元和非神經元細胞簇，包括谷氨酸能神經元、γ-氨基丁酸能（GABAergic）神經元、神經膠質細胞和神經母細胞等（圖1A、1B）。每種細胞類型都存在于每個顯微切割的區域中（圖1C），并鑒定出每簇細胞的標記基因（圖1D、1E）。研究人員進行了免疫熒光染色和原位RNA雜交鏈式反應，根據標記定位組織中的主要細胞類型（圖1F）；然后分析了每個細胞群在大腦皮層區域的豐度（圖1G）。這些數據提供了蠑螈端腦中細胞群的概況，表明了神經發生中的區域特異性。
圖1 蠑螈端腦的單細胞圖譜
2. 蠑螈端腦谷氨酸能神經元區域的保守性
分析數據顯示，29個谷氨酸能神經元簇在內側、背側和外側區域均有分布（圖2A、2B）。研究人員通過物種共有的差異表達基因或轉錄因子來探索蠑螈谷氨酸能神經元的潛在同源性（圖2C、2D），并將研究重點放在具有一致相似性的谷氨酸能神經元上。研究人員進行空間轉錄組研究，得到了大約1~30個細胞的空間分辨率（圖2E），發現蠑螈內側皮層的神經元與羊膜動物海馬神經元具有轉錄相似性。兩棲動物大腦皮層的功能之一是處理嗅覺輸入，而蠑螈谷氨酸能神經元簇（Glut1）和海龜主要嗅覺輸入接受區具有高相關性（圖2D）。Glut1中表達Rorb、Reln、Grik1和Tbr1這些相同的標記基因（圖2F），通過結合Satb1和Rorb的表達來確定Glut1在背外側區的位置（圖2G），這與空間轉錄組中的位置一致（圖2E）。然后，研究人員通過向Glut1所在區域注射雙向示蹤劑神經生物素來分析神經投射（圖2H）。主嗅球、副嗅球、尾側大腦皮層（外側杏仁核）和丘腦中的細胞標記表明，這些區域中的神經元投射到含Glut1的結構域，表明蠑螈端腦具有與羊膜動物嗅皮層轉錄相似的神經元，并存在嗅覺加工一致的投射。
圖2 蠑螈端腦谷氨酸能神經元的保守性
3. GABAergic神經元具有的羊膜動物保守特征
研究人員在蠑螈端腦內鑒定了30個GABAergic神經元簇（n=15,665個細胞；圖3A、3B）。在許多脊椎動物中，GABAergic神經元產生于外側、尾側和內側神經節突起（分別為LGE、CGE、MGE），并在發育過程中遷移至大腦皮層。為了解蠑螈GABAergic神經元的保守性，根據保守轉錄因子的表達，識別LGE樣、CGE樣和MGE樣神經元簇并進行了跨物種比較（圖3C、3D），發現蠑螈端腦LGE樣紋狀體或嗅球類與海龜、小鼠有轉錄相似性。研究人員根據GABAergic神經元標記基因確定其在大腦皮層的分布（圖3E），發現CGE、MGE來源GABAergic細胞群分布于所有區域，LGE來源GABAergic細胞群則主要位于紋狀體中，如在羊膜細胞中。總之，這些數據提示蠑螈端腦的GABAergic神經細胞的來源（即細胞遷移和定位）。
圖3 蠑螈端腦GABAergic神經元的保守特征
4. 蠑螈端腦中室管膜細胞和神經母細胞的多樣性
蠑螈中樞神經系統中的主要神經膠質細胞是室管膜膠質細胞，其在發育、生長和再生中產生神經元。研究人員鑒定了蠑螈端腦室管膜膠質細胞（3,590個細胞）的多樣性，并確定了15個轉錄上不同的細胞簇。將這些細胞簇分為3種類型：靜息態（quiescent）、活躍態（active）和前神經室管膜膠質細胞（pro-neuro）（圖4A）。靜止態細胞不發生增殖，表達內皮素3（Edn3），活躍態細胞表達Notch1且細胞周期評分高，前神經室管膜膠質細胞表達神經元相關基因，如Grin1（圖4B、4C）。內側、背側和外側中的室管膜膠質細胞之間存在明顯的轉錄差異（圖4C、4D）。在端腦內側、背側和外側檢測標記基因表達（圖4E）。
研究人員鑒定了神經母細胞，神經母細胞高表達Mex3a，并低表達室管膜膠質細胞標記基因，如Gli2、Aqp4和Kcnj10。15個神經母細胞簇分為兩組，分別表達Slc17a6/7 (VGLUT+)或Gad1/2 （GABA+）（圖4F）。但與在其他脊椎動物腦中發現的神經母細胞不同，Mex3a+成神經細胞在很大程度上是不增殖的（圖4G）。HCR結果顯示，所有大腦皮層區域都存在VGLUT+神經母細胞，而GABA+神經母細胞主要存在于紋狀體腦室中（圖4H）。為了確定蠑螈室管膜膠質細胞和神經母細胞與小鼠神經干細胞和祖細胞的轉錄相似性，研究人員對成年小鼠數據集（圖4I）進行了聚類相關分析和跨物種數據整合，結果表明，蠑螈端腦包含已經表達下游神經元的神經遞質信號的神經母細胞群；神經母細胞與小鼠祖細胞和神經母細胞最相似，而室管膜膠質細胞在轉錄上與小鼠室管膜細胞和神經干細胞最為相似。
圖4 蠑螈端腦室管膜膠質細胞和神經母細胞的多樣性
5. 胚胎發育后谷氨酸能神經發生的轉錄變化
研究人員使用Cre-loxP介導的示蹤法標記室管膜膠質細胞，以研究它們的再生特性，并確定它們在胚胎后神經發生期間的克隆模式（圖5A），這揭示了內側、背側和外側區域不同的神經發生模式。內側和背側克隆是連續的堆積生長模式，而外側克隆是神經元遷移模式。使用RNA速率軌跡推斷蠑螈胚胎后神經發生的細胞和分子變化，構建了代表不同區域特異性神經發生的軌跡（圖5B、5C）。所有的軌跡都起源于活躍態室管膜膠質細胞，并且海馬神經元簇、外側皮質簇都含有神經母細胞中間體，但背內側神經元簇則沒有，因此推斷其起源于前神經室管膜膠質細胞。研究人員鑒定了擬時序特異性變化表達的基因（圖5D）。
為了解決谷氨酸能神經發生的基因調控關系，對蠑螈整個大腦皮層進行單核多組學測序，評估基因調控區的差異染色質可及性（圖5E、5F）。大多數谷氨酸能神經元簇特異性基因的調控元件在軌跡早期已經在相應的神經母細胞簇中獲得了染色質可及性。通過結合基因表達、染色質可及性和轉錄因子（TF）結合基序構建出基因調控網絡（gene regulatory network，GRN）。GRN的UMAP嵌入揭示了不同的TF組，對應于從室管膜膠質細胞向谷氨酸能神經元的轉變（圖5G）。為了更好地理解基因調控在神經元軌跡之間的差異，進行差異可及性分析，確定了每個軌跡中富集的調控區域并構建出反映軌跡特異性調控特征的GRN子網絡（圖5H），從而識別出具有高中心性的TF，如海馬中的Nr3c2、Foxo3和Mef2a（圖5I）。總之，這些數據構建了蠑螈端腦神經元多樣化的調節關系。
圖5 谷氨酸能神經發生的轉錄變化
6. 蠑螈端腦再生的分子變化
為了研究蠑螈端腦再生過程中的細胞和分子變化，研究人員使用Div-Seq技術，其將snRNA-seq與S期細胞的EdU標記相結合。研究人員損傷蠑螈端腦的背側區域（包括Satb1+和Rorb+結構域），并在損傷后第2、5、12、19和26 d用EdU標記細胞，在整個再生過程中收集EdU+細胞進行Div-Seq（圖6A）。為了觀察再生過程中EdU+細胞的位置，研究人員在再生腦中對EdU進行了熒光標記（圖6B）。接下來，研究人員研究了再生過程中EdU+細胞的轉錄組，以穩態數據作為參考確定所有主要的細胞類型（圖6C）。每種細胞類型在整個再生過程中以不同的比例出現（圖6D）。在損傷后1周，活躍態室管膜膠質細胞構成了大多數EdU+細胞，而在損傷后2周和4周，神經母細胞是最豐富的細胞類型。從損傷后6周開始，大多數EdU+細胞是谷氨酸能和γ-氨基丁酸能神經元。
為了解端腦損傷是否誘導室管膜膠質細胞轉錄組變化，研究人員通過整合和聚類兩個數據集，并評估不同時間點每個聚類中的差異豐度和表達，比較了DivSeq和穩態室管膜膠質細胞（圖6E）。研究人員發現三個細胞簇（簇8、20和21）在損傷后1周和2周強烈富集，在以后的時間點和穩定狀態下很少或不存在（圖6F）。簇21細胞差異表達基因如Kazald1、Runx1等與傷口愈合和細胞粘附相關，表明對損傷的早期反應程序（圖6F~H）。Kazald1和Runx1的染色證實，在未損傷的端腦中沒有表達，在損傷后1周的端腦中有較強的表達（圖6I）。
Div-Seq的神經母細胞和神經元的投影和分類顯示，大多數穩態細胞在再生期間重建（圖6J）。HCR染色證明了損傷后4~8周之間Satb1+、Rorb+谷氨酸能神經元的恢復（圖6K）。然后，使用軌跡分析確定了再生和穩態神經發生軌跡之間的高度相似性（圖6L、6M）。最后，為了確定再生的Satb1+、Rorb+神經元結構域是否重建投射，研究人員將神經生物素注射到未損傷和再生腦中的Satb1+、Rorb+區域，并進行整體免疫組織化學以鑒定細胞體和突起。與未受傷的大腦類似，染色的細胞體位于嗅球、副嗅球和尾端端腦（杏仁核）中，表明來自這些區域的輸入在受傷再生的端腦中重建（圖6N）。
圖6 蠑螈端腦再生的分子變化
結論
本研究結果表明，與哺乳動物端腦區域相關的細胞類型和基因表達模式在兩棲動物的大腦中存在。在蠑螈中，端腦神經發生通過不同的神經母細胞祖細胞進行，這些祖細胞與特定的神經元類型相關，并依賴于共有且特定的調節程序。在再生神經發生中存在這些相同的程序，表明腦損傷在誘導損傷特異性室管膜細胞狀態后通過相同途徑激活神經發生，再生的神經元重新建立與大腦遠端區域的連接。本研究對蠑螈大腦如何再生的見解可能會為其他生物的大腦再生研究提供信息。
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系列導讀
● 文獻解讀 | Science封面：Stereo-seq鑒定蠑螈端腦再生過程中的重要神經干細胞亞型
●Science | MERFISH揭示人和小鼠大腦皮層細胞的保守性和差異性
●Nat Neurosci | 單細胞原位轉錄組圖譜揭示哺乳動物大腦皮層中星形膠質細胞分層
● Nature Neuroscience | 小鼠大腦星形膠質細胞異質性炎癥響應的時空圖譜
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