枯葉龜在年齡還比較小的時候，基本是沒辦法區分雌雄的，尤其是剛出生的枯葉龜，是無法區分雌雄的。區分雌雄需要在性腺開始發育之后進行，或者等到雄枯葉龜和雌枯葉龜在外觀上的區別特征變得明顯之后才能區分。一般情況下，人工養殖的枯葉龜，需要養殖2-3年才能夠比較明確地區分雌雄。
雌枯葉龜的體長通常要較雄枯葉龜大一些，與其他的成年龜一樣，雄枯葉龜有著較雌枯葉龜長和寬的尾巴。還可以在枯葉龜發育后將枯葉龜的腹甲朝上，左手的大拇指、食指二中指分別將枯葉龜的前肢、頭壓迫縮入殼內，右手將枯葉龜的尾擺直，若枯葉龜的泄殖腔孔內有黑色的陰莖伸出，則為雄枯葉龜，若枯葉龜的泄殖腔孔排出泡泡或稀粘液，則為雌枯葉龜。
